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Un primer indicio de una fisiología CLC inusual en bacterias surgió recientemente de un pequeño clado evolutivamente distante de los miembros bien estudiados de la superfamilia (Fig. 1). Baker y sus colegas describieron un motivo de ARN regulador conservado que induce la transcripción de genes posteriores cferecibos.mx al unirse al ion F-; Recientemente se resolvió una estructura de cristal de rayos X de un F-riboswitch. Los genes controlados por estos riboconmutadores codifican enzimas sensibles a F, incluidas enolasa y pirofosfatasa, así como proteínas de membrana, incluidos miembros de la superfamilia CLC.

-114 y NaCl 1 M, y cromatografía de intercambio iónico en tándem sustituida para el paso Superdex200. La proteína eluida de la columna de colbalto estufas-electricas.com se diluyó 10 veces en tampón IE (NaCl 10 mM, DM 5 mM, Mes-NaOH 10 mM pH 6,5) y se aplicó a una columna de intercambio catiónico de 2 ml.

Los CLC asociados a riboswitch se agrupan dentro de un solo clado en el árbol filogenético, aunque no todos los CLC de este clado están regulados por riboswitches. En consecuencia, se sugirió que estos CLC actuaran como exportadores de F que protegen a las bacterias de la toxicidad ambiental de F, una idea respaldada por la demostración de que CLC-psy rescata la detención del crecimiento dependiente de F en E. coli y cataliza un fuerte flujo de F en liposomas reconstituidos.

Estamos sorprendidos por las diversas sorpresas que ya han surgido de esta encuesta. Estas sorpresas presagian una comprensión más profunda y más amplia de toda la familia CLC a seguir de estudios más detallados del mecanismo de transporte y la biología F procariota y, finalmente, de las estructuras de alta resolución. QuickTSI proporcionará este sitio web / perfil como una plataforma de marketing para F Todos los puntos de datos son estimaciones proporcionadas por el equipo de Clutch. Para destinos de larga distancia y envíos que no requieren un envío rápido, nuestro servicio intermodal ferroviario es una opción alternativa inteligente. La mayor parte del flete es flete directo del cliente de bajada y gancho. El resto está reservado para completar los retrocesos o la ruta a otro carril.

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• • Las proteínas cotransportadoras utilizan el gradiente de H para introducir moléculas de sacarosa a medida que los iones H se difunden hacia abajo en el gradiente de concentración.
• • Las células compañeras usan ATP para transportar activamente iones H fuera de la célula.
• • Esto crea un gradiente de concentración con más iones H en el tejido circundante que la célula compañera.
• Para el análisis de RMN, se formaron liposomas a una concentración de 20 mg de lípido / ml, 40 µg de proteína / ml y se cargaron con KF 300 mM, Hepes 10 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5.

A continuación, esta columna se lavó con 10 volúmenes de tampón IE ajustado a pH 5,5, tampón IE NaCl 100 mM y tampón IE NaCl 200 mM. El eluato se concentró aproximadamente 10 veces, se diluyó en tampón IE y se aplicó a una columna de intercambio aniónico de 2 ml, a la que no se une CLC-eca. El ensayo se concentró y se utilizó para la reconstitución como se indicó anteriormente, usando 7,5 mg / ml de 1-palmitoílo, 2-oleoilfosfatidiletanolamina 2,5 mg / ml de 1-palmitoílo, 2-oleoilfosfatidilglicerol (POPE / POPG) a una alta densidad proteica, 50– 70 μg / mg de lípidos. Las construcciones de genes sintéticos que codifican homólogos de CLC con etiquetas de hexahistidina C-terminal se adquirieron en Genscript y se insertaron en el vector de expresión pBAD18 usando sitios de restricción XbaI / HindIII. coli (cepa de fondo BW2113 o ΔcrcB) con pBAD que contenía el inserto de CLC. Los cultivos de una noche de colonias individuales se diluyeron 100 veces en LB y se cultivaron durante aproximadamente 2 veces antes de inducir la expresión de proteínas con arabinosa al 0,2%.

El transporte fue iniciado por Vln 10 s después del comienzo de las trazas. de una solución interna rica en K a una solución externa rica en Na se muestra como una disminución dependiente del tiempo del pico de KF concomitante con un aumento del pico de NaF (Fig. 3B). Hasta ahora hemos seleccionado 29 miembros del clado CLCF para la sobreexpresión en E. Ocho homólogos producen proteína de calidad suficiente para estudiar el transporte de F en proteoliposomas reconstituidos. coli no lleva ningún gen CLCF, sino que utiliza un exportador de la familia crcB no relacionada, cuya eliminación hace que la bacteria sea muy sensible a F-. Transformamos esta cepa ΔcrcB con un vector de rescate inducible por arabinosa que porta genes CLCF para ser probado, monitoreando el crecimiento en LB suplementado con NaF. Mientras que el crecimiento de las células de tipo salvaje no se ve afectado por F- 5 mM, la cepa crcrcB se detiene casi completamente por F- 0,5 mM (Fig. 2).

La inhibición se puede prevenir suministrando a las células ΔcrcB un homólogo de CLCF (Fig. 2A). El vector de rescate expresó con éxito la proteína para siete de los homólogos de CLCF, mantenimiento de flota y todos estos rescataron ΔcrcB contra la toxicidad F- (Fig. 2B, Tabla 1). Es notable que CLC-ec1, un antiportador Cl- / H, no rescata, de acuerdo con su selectividad por Cl- sobre F-.

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Después de una hora, se añadió NaF a la concentración deseada, después de lo cual se controló el crecimiento mediante densidad óptica. La expresión de proteínas se confirmó mediante transferencia Western contra la etiqueta de hexahistidina. En resumen, los antiportadores CLCF representan una desviación dramática en secuencia, función y mecanismo de los miembros familiares de la superfamilia CLC. Este trabajo proporciona un esquema inicial de su papel fisiológico idiosincrásico, exquisita selectividad F y peculiaridades mecanicistas sin precedentes.

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Para la preparación ultrapura de CLC-eca requerida para el registro de bicapa plana, que no puede tolerar más de una parte en 105 de la contaminación por porinas de la membrana externa endógenas a E. coli, el procedimiento de purificación incluyó lavados adicionales de columna de cobalto con Triton-X al 0,1%.