Mecanismos de transporte de sodio en bacterias en Jstor

Recopilación de datos de microscopía electrónica (em)

Las muestras se homogeneizaron (Avestin EmulsiFlex-C3) y se centrifugaron a 17.000 g durante 10 min para eliminar las células no lisadas antes de la ultracentrifugación. Las membranas se centrifugaron usando un rotor Beckman Ti45 a 100.000 g durante 1 hora y luego se añadieron a la parte superior de un gradiente de sacarosa. Nuestros gradientes de sacarosa contienen tres concentraciones distintas de sacarosa, y las membranas interna y externa se separan en bandas distintas que se recolectan individualmente (Figura 5 – Figura 3F).

Determinación de cristalización y estructura de Mlac

En opinión de este revisor, la carga de la prueba es ahora mayor dado el trabajo anterior sobre el sistema E. Las células se resuspendieron en 20 ml de sacarosa elaspirador-escoba.com 0,5 M, Tris 10 mM pH 7,8, 75 µg de lisozima recién preparada y 20 ml de EDTA 0,5 mM y se mantuvieron en hielo con agitación suave durante 20 min.

1) Como se señaló anteriormente, el sistema Mla se ha caracterizado previamente en E. coli y se ha formulado la hipótesis de que es un transportador GPL retrógrado. Claramente, el sistema mla panelessolares-precios.com no es necesario para el crecimiento, por lo que si está funcionando como un transportador anterógrado, lo que está reemplazando a las GPL en el prospecto interno del OM en los mutantes mla.

Captación de fosfato por el sistema de transporte de fosfonato Phncde

Aunque la proporción de OM es similar en los mutantes y el tipo salvaje, lo que es significativo es la discrepancia en las proporciones entre las membranas interna y externa. A medida que la proporción de marcado a no marcado aumenta en el IM con el tiempo, también debería aumentar a la misma velocidad en el MO, siempre que no se inhiba el transporte anterógrado entre las membranas, como lo demuestran los resultados de estos experimentos en tipo salvaje. La importancia de nuestro resultado es que la GPL recién sintetizada se acumula en el MI a un ritmo más rápido que en el OM en nuestros mutantes, lo que indica que algún mecanismo de transporte anterógrado está inhibido en estas cepas. Sin embargo, como notamos en la discusión, el transporte al OM no está completamente abolido, ya que todavía hay GPL etiquetados que aparecen en el OM en estas condiciones.

baumannii ATCC se subclonó en el vector pET-28a con una etiqueta de hexahistidina (-6HIS) fusionada en el extremo cuentos-infantiles.net C-terminal de la proteína MlaB. La secuencia de nucleótidos del operón se confirmó mediante secuenciación de ADN.

Las células se cultivaron a 37 ° C en medio LB hasta que la densidad celular alcanzó una DO600 de 1,0. A continuación, se redujo la temperatura a 16ºC antes de la inducción con β-D-tiogalactósido de isopropilo 1 mM. Después de crecer a 16 ° C durante 18 h, las células se recolectaron usando centrifugación a 4.200 g. Las células se resuspendieron en tampón A helado (Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, glicerol al 5% (v / v)) y se sometieron a tres ciclos de homogeneización a 10,000-15,000 psi usando Avestin EmulsiFlex-C3 homogeneizador de alta presión. El homogeneizado se centrifugó a 17.000 g durante 10 min a 4ºC y luego el sobrenadante se ultracentrifugó a 100.000 g durante 60 min. La fracción de membrana se resuspendió en tampón A suplementado con dodecil-β-d-maltopiranósido al 1% (p / v) y se agitó lentamente durante 1 hora a 4ºC.

• La viabilidad de la triple deleción elimina la posibilidad de que estos sistemas funcionen colectivamente como transportadores anterógrados redundantes, un punto clave al considerar la direccionalidad del transporte.
• Cada una de estas proteínas forma hexámeros simétricos con los dominios MCE apilados verticalmente.
• A partir de análisis genéticos, MlaD parece ser dominante ya que un mutante mla parece tener fenotipos idénticos al mutante triple mla, pqi, yeb con respecto a la sensibilidad a los detergentes.
• El trabajo estructural mostró que cada uno de los 3 operones MCE transcribe proteínas que tienen un número variable de dominios MCE y estructuras cuaternarias radicalmente diferentes.

La pureza de la separación de membranas mediante este método se confirmó mediante el ensayo NADH y mediante transferencia Western para la proteína OmpA localizada en OM de A. baumannii, con 10 µg de proteína total cargados en cada carril según lo medido por el ensayo de proteína Bradford (Figura 5 — suplemento de figura 3).