Métodos para estudiar el transporte en bacterias

Transporte activo primario

También es de interés el papel potencial del aumento de exopolisacárido observado tras la interrupción del sistema Mla. Es posible que este exopolisacárido juegue un papel parcialmente compensador en A. baumannii como resultado de la disminución de la GPL de OM, dado que un trabajo reciente ha demostrado que los exopolisacáridos de A. baumannii pueden contribuir a la resistencia a los antibióticos, probablemente a través de una función de barrera mejorada. Tras la introducción del acetato 2-13C como única fuente de carbono, se sintetizaron inmediatamente GPL marcadas con 13C en el citoplasma bacteriano. Razonamos que el crecimiento continuo en acetato de 13C debería resultar en un grupo mixto de moléculas IM GPL marcadas y no marcadas.

Los primeros tres genes del operón mla, que comprenden una ATPasa, permeasa y componentes de unión al sustrato del complejo transportador ABC, se conservan en Mycobacteria spp, Actinobacteria y cloroplastos, mientras que todo el operón de cinco genes parece conservarse en Gram -bacterias negativas. Dada la conservación del sistema en especies Gram-negativas, nuestros resultados pueden arrojar luz sobre un mecanismo generalizado que contribuye a la biogénesis de la OM. Además, aquí hemos demostrado que la función de este sistema de transporte ABC es crucial para mantener la integridad de A. El hecho de que se toleren mutaciones de mla y de que los niveles de OM GPL se reduzcan pero no se supriman, sugiere la posibilidad intrigante de mecanismos adicionales no descubiertos de entrega de GPL a OM.

Cada componente de la cadena puede primero aceptar y luego liberar un electrón. Tras la liberación del electrón, la proteína está lista para aceptar otro electrón. La cadena de transporte de electrones puede concebirse como una serie coordinada y continua de conmutaciones de sus constituyentes desde la aceptación de electrones hasta el modo de liberación de electrones. pneumoniae puede internalizar el R-825, lo que se acompaña de la disminución de la captación bacteriana de hierro (Fig. 3A).

En microorganismos como las bacterias, la maquinaria del complejo de transporte de electrones se aloja en la membrana única de las bacterias Gram-positivas o en la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. El proceso de transporte de electrones se inicia mediante el movimiento activo, que requiere energía, de los protones buenos-dias.net desde el citoplasma interior similar a un gel de la bacteria a una proteína denominada NADH. Al hacerlo, el NADH se convierte en NAD, con la consiguiente liberación de un electrón. El electrón liberado luego comienza un viaje que lo mueve secuencialmente a una serie de aceptores de electrones colocados en la membrana.

• Ninguno de los dos está asociado con un transportador ABC, por lo que es más probable que diferentes dominios MCE dentro del polipéptido dado tengan diferentes afinidades por el sustrato o cambios conformacionales in vivo para impulsar el sustrato a través de la acción peristáltica.
• Aunque se ha demostrado que se une a las GPL, no hay evidencia bioquímica o genética directa sobre la función de Pqi y Yeb en bacterias Gram negativas.
• Las estructuras cuaternarias sugieren mecanismos independientes para transportar sustratos; sin embargo, el mecanismo por el cual se produce el transporte a través de los complejos Pqi y Yeb es difícil de alcanzar.
• baumannii tiene un sistema Pqi homólogo, nunca se mutó en la evolución de A.

El sistema Acinetobacter Baumannii Mla y el transporte de glicerofosfolípidos a la membrana externa

Después de otra ultracentrifugación a 100.000 g durante 30 min, se recogió el sobrenadante y se cargó en 2 ml de resina de afinidad de nitrilotriacetato de Ni2 (Ni-NTA de Qiagen, Alemania) preequilibrada elaspirador-escoba.com con tampón A suplementado con imidazol 5 mM y 0,025% (w / v) DDM. Después de incubar durante 1 hora, la resina se lavó con 50 ml de tampón A complementado con imidazol 20 mM y DDM al 0,025% (p / v).

Expresión y purificación de proteínas de Mlafedb

La muestra de proteína se eluyó con 10 ml de tampón de elución que contenía tampón A, imidazol 300 mM y DDM al 0,025% (p / v) y se concentró hasta 0,5 ml. Después, la muestra de proteína concentrada se cargó en una columna software almacen Superdex-200 (10/30, GE Healthcare, EE.UU.) preequilibrada con Hepes 20 mM (pH 7,0) Nacl 150 mM, DDM al 0,025%. Se recogieron las fracciones máximas y la muestra de proteína reunida se concentró a 1 mg / ml.

Una comparación de las proporciones de GPL marcada y sin marcar en el IM y el OM reflejará así la eficiencia del transporte entre las membranas, y el análisis del transporte en A. baumannii de tipo salvaje establecerá una referencia para la eficiencia del transporte con la que comparar nuestros mutantes. Además, las fosfolipasas de OM, algunas de las cuales pueden activarse tras el daño de la membrana, no distinguirán entre GPL marcada y no marcada y, por lo tanto, no afectarán la proporción de GPL marcada a no marcada obtenida de este ensayo.

En consecuencia, se estimuló la expresión de las lipoproteínas PiaA y PiuA en la bacteria para compensar la disminución de la disponibilidad de hierro bajo la competencia de R-825 (Fig. 3B En nuestra investigación a largo plazo sobre el mecanismo de adquisición de hierro en las bacterias, entendemos que la mayor parte del hierro obtenido por las bacterias se encuentra en forma de sideróforos o hemo, ya que el ión de hierro libre está severamente restringido en el huésped. En consecuencia, bloquear o interferir software transportes con la vía de captación de hemo o sideróforo sería un enfoque eficaz para limitar la adquisición de hierro, uno de los elementos cruciales para el crecimiento y la supervivencia bacterianos. Tanto el rutenio como el hierro son miembros de la familia VIII en la tabla periódica, y comparten similitudes químicas en términos de coordinación y unión con ligandos. Más importante aún, Ru no es tóxico para el cuerpo humano, lo que lo convierte en un excelente candidato para el desarrollo de fármacos antimicrobianos.

A medida que las GPL pasan luego del IM al OM, la probabilidad de que se transporte una molécula de GPL individual es directamente proporcional a la proporción de GPL marcada y no marcada en el grupo de IM. A medida que las bacterias continúan creciendo en acetato de 13C, la proporción de GPL marcada y no marcada en el MI aumentará gradualmente a medida que se sintetizan e insertan nuevas GPL en el MI. Como tal, la probabilidad de transportar la GPL etiquetada al OM también aumentará.